3. DIAGNOSI: come formularla

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3. DIAGNOSI: come formularla


Articolo scritto da:

Jesús Salinas, Nieves Ortega, María Rosa Caro
Dipartimento della salute degli animali, facoltà di medicina veterinaria, Università di Murcia. 30100 Murcia, Spagna.


Come nel caso di tutte le malattie abortive di origine infettiva, la diagnosi precoce è essenziale ai fini della messa a punto di misure igienico-sanitarie e dei trattamenti necessari per arginare le ripercussioni sul piano clinico ed economico generate dall’infezione nel gregge.


La diagnosi precoce consente altresì di sviluppare adeguati interventi profilattici o vaccinali tesi a prevenire un incremento degli aborti negli anni successivi.


Diagramma che mostra i principali metodi utilizzati nella diagnostica di laboratorio di aborto enzootico ovino i

Figura 2: Diagramma che mostra i principali metodi utilizzati nella diagnostica di laboratorio di aborto enzootico ovino in funzione dei campioni raccolti dopo un’epidemia di aborti.

 

Tuttavia, considerando che i segni clinici ed epidemiologici non sono specifici, ai fini della conferma dei casi di aborto da Chlamydia, nella maggior parte dei casi è essenziale ricorrere alla diagnostica di laboratorio (Figura 2).
 

Segni clinici e dati epidemiologici


I segni clinici che mostrano l’interessamento di un gregge da aborto enzootico ovino non sono sufficientemente chiari per formulare una diagnosi certa della malattia.


Esistono altre malattie abortive che colpiscono i piccoli ruminanti e che presentano una sintomatologia analoga, come febbre Q, brucellosi, aborto da Salmonella Abortusovis o toxoplasmosi; questo è il motivo per cui l’unico metodo utile alla formulazione di una diagnosi certa è la conferma con esami di laboratorio.
 

Diagnosi di laboratorio: l’unico metodo di conferma possibile


Ciò premesso, è pertanto necessario seguire un iter diagnostico in laboratorio, che può essere svolto direttamente sui prodotti dell’aborto o indirettamente su campioni di siero.

1. Selezione dei campioni


Nel caso della diagnosi diretta, il campione di elezione è la placenta.


La diagnosi indiretta richiede invece il prelievo di campioni di sangue dai capi che hanno abortito di recente.

La diagnosi indiretta richiede invece il prelievo di campioni di sangue dai capi che hanno abortito di recente.

 

La procedura richiede la raccolta e l’inserimento in sacche di plastica sterili o il fissaggio in formalina, in base alle analisi richieste (batteriologiche, molecolari o immunocitochimiche), di diversi cotiledoni.
 

La placenta è il campione ideale per le tecniche di diagnosi diretta


Se la placenta non è disponibile, possono essere analizzati campioni prelevati dal feto (milza, fegato, contenuto dell’abomaso o polmoni), anche se in questi casi è opportuno effettuare dei tamponi vaginali dopo l’aborto, poiché l'escrezione dell’agente patogeno nelle secrezioni rimane molto consistente per diversi giorni o settimane.
 

Diagnosi diretta: tamponi vaginali

Diagnosi diretta: tamponi vaginali effettuati nella prima settimana dopo l’aborto

 

La diagnosi indiretta si esegue, invece, su campioni di siero.

In questo caso, è consigliabile prelevare almeno 10 campioni da più capi di uno stesso gregge che hanno abortito. Dato che il livello di anticorpi può andare incontro a un rapido calo, i campioni devono essere prelevati entro 8 settimane dopo il picco massimo di aborti nel gregge.
 

I campioni di siero devono essere prelevati entro 8 settimane dall’aborto


Se si trattano singoli sieri da capi che hanno abortito, occorre prelevare due campioni di sangue entro 15-20 giorni (campioni di siero abbinati), al fine di accertare che sia avvenuto il processo di sieroconversione.
 

2. Diagnosi diretta


Prevede una serie di tecniche indicate per l’individuazione dell’agente infettivo sui campioni patologici, e più precisamente i seguenti metodi:
 

Figura 3: Diagnosi diretta di aborto enzootico ovino. Individuazione di C. abortus mediante: 
A. Colorazione di Stamp. B. Colorazione di May-Grünwald-Giemsa. C. Immunoistochimica su sezione istologica D. Immunofluorescenza.

 

  • Esame batterioscopico: è un’analisi che permette di dimostrare la presenza di C. abortus in laboratori non specialistici. Rientrano in questa metodica sia le colorazioni differenziali tradizionali, come quella di Stamp (Figura 3A) o di May-Grünwald-Giemsa (Figura 3B), sia le tecniche dirette sviluppate più di recente di immunofluorescenza (Figura 3D) o immunoenzimatiche (Figura 3C) per l’individuazione dell’antigene, che sono più specifiche e più sensibili in associazione all’utilizzo di anticorpi monoclonali. Queste tecniche di analisi sono applicabili a tamponi su cotiledoni o vaginali e sono meno sensibili se vengono svolte su organi fetali. I campioni di cotiledoni possono anche essere fissati in formalina e inclusi in paraffina per analisi immunocitochimica su sezioni istologiche.

 

  • Coltura: dato il carattere del microrganismo intracellulare, la sua coltura richiede l'impiego di cellule viventi. Il primo metodo sviluppato per la coltura di Chlamydia prevedeva l’impiego del sacco vitellino di embrioni di pollo e ancora oggi trova comune impiego nella prassi di routine di molti laboratori. Nel tempo, il  metodo di coltura si è tuttavia orientato in larga misura dalle uova embrionate verso le linee cellulari. Le linee cellulari sensibili più utilizzate sono le McCoy, Vero, HeLa 229 o le cellule L dei fibroblasti.

 

  • Tecniche molecolari: la possibilità di rilevare in maniera rapida e precisa la presenza di Chlamydia su campioni clinici è sensibilmente migliorata dopo l'introduzione delle metodiche molecolari, in particolare delle tecniche di amplificazione genica (PCR), che possono essere eseguite sugli stessi campioni, sia freschi sia congelati, o anche su campioni fissati in formalina. A differenza della PCR convenzionale, la PCR real time permette di quantificare la presenza di Chlamydia nel campione.

 

La PCR è pertanto una tecnica diretta rapida e precisa

 


3. Diagnosi indiretta o sierologica


La diagnosi sierologica di aborto enzootico ovino è complessa per svariati motivi, ma soprattutto in ragione della natura latente dell’infezione: ciò significa che la sieroconversione avviene soltanto dopo l’aborto.


Inoltre, i ruminanti contraggono spesso anche l’infezione da C. pecorum, in molti casi in forma subclinica, che tuttavia induce la produzione di una quantità bassa, ma rilevabile, di anticorpi.


Per i suddetti motivi la diagnosi sierologica deve tassativamente essere una diagnosi di gruppo o gregge.


Il gregge si considera interessato da un’infezione latente (o quando vaccinato di recente) in presenza di percentuali di anticorpi pari o lievemente maggiori della soglia di positività delle tecniche utilizzate, tenendo conto di un gregge presumibilmente esente quando tutti i campioni di siero analizzati danno valori minori del valore soglia stabilito.


I metodi più utilizzati sono i seguenti:
 

  • Test di fissazione del complemento (CFT): da oltre 50 anni, il CFT è la tecnica più diffusa per la diagnosi sierologica di aborto enzootico ovino ed è inoltre raccomandata dall'Organizzazione mondiale della sanità animale (OIE). Non è tuttavia specifica, poiché l'antigene utilizzato consiste principalmente di lipopolisaccaride (LPS), che è comune a tutte le specie della famiglia Chlamydiaceae, rendendo comune l’insorgenza di reazioni crociate con gli anticorpi prodotti contro C. pecorum.

 

  • Dosaggi immunoenzimatici del tipo ELISA: è la tecnica che attualmente trova maggiore impiego. È fondamentale usare i kit disponibili in commercio che utilizzano antigeni ricombinanti specifici di C. abortus correlati al test 80-90 kDa POMP-based ELISA, escludendo quelli che utilizzano corpi elementari completi o LPS, che possono dare origine a reazioni crociate con le risposte indotte da C. pecorum.
     

La tecnica indiretta di elezione è il test ELISA

 

Controllo e prevenzione


Le misure per la prevenzione e il controllo dell’aborto enzootico ovino sono tre:
 

  • Misure generali di gestione, simili a quelle di qualsiasi processo abortivo.
     
  • Trattamento con antibiotici, come tetracicline, dopo un’epidemia di aborti.
     
  • Profilassi vaccinale, con due tipi di vaccini attualmente disponibili; vaccini vivi attenuati e vaccini inattivati.

 

 

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BIBLIOGRAFIA: 
 

Considerata l’estesa bibliografia utilizzata per la stesura del presente articolo, i riferimenti non sono stati citati. Se il lettore desidera ulteriori informazioni su qualsiasi aspetto di questa monografia, può rivolgersi agli autori scrivendo al seguente indirizzo e-mail: jsalinas@um.es

 


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