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GUMBOHATCH® INSIGHTS #9

Página inicial Conhecimento GUMBOHATCH® INSIGHTS #9

Controlar a Doença de Gumboro, estou a fazer o suciente? - Parte 2


A doença infeciosa da bursa (IBD) representa uma das principais ameaças para a avicultura, principalmente devido à grave imunossupressão induzida pelo vírus (IBDV) nas aves afetadas. A IBD requer um diagnóstico rápido para uma reação imediata em caso de surto. Assim, ferramentas moleculares como o PCR e a sequenciação tornaram-se indispensáveis para o controlo da doença.

Por esta razão, a HIPRA oferece um programa de diagnóstico molecular para a IBD, conhecido como "GUMBOCHECK."

GUMBOCHECK

GUMBOCHECK é um pack de diagnóstico que inclui um cartão FTA, um formulário para anotar os dados dos animais de que foram recolhidas as amostras e um pequeno guia que mostra como realizar uma boa amostragem para obter um resultado positivo.

O principal objetivo do GUMBOCHECK é avaliar a colonização da bursa de Fabricius pelo vírus vacinal, para uma avaliação da eficácia da vacinação. Contudo, também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico no caso de infeção de IBD no campo.

Para isto, é aconselhável realizar esta avaliação em diferentes momentos da vida das aves. Recomenda-se que seja feito aos 21, 28 e 35 dias de idade. No entanto, quando se confirmar a colonização da bursa por HIPRA 1052 (estirpe GUMBOHATCH®), podem ser ignorados os pontos de amostragem subsequentes.


PASSO DO GUMBOCHECK

 

1. AMOSTRAGEM

A amostragem de IBD é realizada com um cartão FTA. O que é um cartão FTA e como funciona?

  • Um cartão FTA é um pedaço de papel com uma matriz de celulose projetada para capturar células dentro das amostras biológicas.

  • Após esta captura, as membranas das células quebram-se (paredes bacterianas ou capsídeos virais), facilitando a estabilidade do material genético à temperatura ambiente durante muito tempo.

  • Devido à rutura destas membranas, as amostras biológicas inoculada em cartões FTA  são consideradas substâncias não infeciosas, uma vez que os agentes patogénicos estão  inativados

  • Os cartões FTA facilitam o envio e armazenamento de amostras biológicas.

  • Assim que o cartão FTA chega ao laboratório, o material genético é facilmente extraído para executar o PCR.

Há alguns pontos críticos que devemos ter em conta quando utilizamos cartões FTA:

  • Existem diferentes tipos de cartões FTA: nem todos funcionam corretamente ou dão os mesmos resultados.  Por esta razão, a HIPRA apenas recomenda a utilização de cartões FTA fornecidos no pacote GUMBOCHECK.

  • Não utilizar cartões FTA expirados: os cartões FTA expirados podem dar resultados falsos negativos, pelo que é importante analisar a data de validade.

  • Inoculação adequada da amostra:  as amostras não devem ser inoculadas fora da área delimitada, a fim de garantir a correta inativação dos agentes patogénicos.

  • Número correto de animais inoculados: os cartões FTA da GUMBOCHECK têm quatro áreas onde são aplicadas amostras. Cada área do cartão tem capacidade para duas aves, o que significa uma capacidade total de oito aves para cada FTA por dia de amostragem.

  • Tempo suficiente: todas as reações precisam de algum tempo após a inoculação para quebrar as membranas e preservar o material genético (pelo menos 1 hora à temperatura ambiente).

 

2. PCR

O PCR é uma técnica de diagnóstico molecular com o objetivo de amplificar o genoma de um agente patogénico presente na amostra. No caso do vírus IBD, o gene amplificado é VP2, uma vez que é a proteína mais imunogénica, localizada na superfície do vírus.

Como funciona o PCR?

  • Esta técnica gera milhões de cópias de um gene específico para ser capaz de detetar uma pequena quantidade do vírus. Permite ter uma amplificação exponencial da quantidade inicial de vírus presente na amostra.

  • Os relatórios de diagnóstico mostram um parâmetro conhecido como valor Ct, que é o número de ciclos que uma amostra precisa de ser detetada como positiva. Por exemplo, se o valor do Ct apresentado for de 32, significará que a amostra precisa de 32 ciclos do PCR para ser detetado como positivo.

    *O valor do Ct é inversamente proporcional à quantidade de material genético presente na amostra.

 

3. TIPIFICAÇÃO DO VÍRUS

Uma vez detetadas amostras positivas com PCR, a tipificação do vírus é realizada para se conhecer o tipo de vírus presente na amostra, ou melhor, para saber se se trata de uma estirpe da vacina ou de uma estirpe de campo. A tipificação é feita por sequenciação.

O vírus IBD pode ser classificado em relação à antigenicidade, mas também no que diz respeito à patogenicidade. Além disso, este vírus está constantemente a evoluir devido a mutações ou combinação de eventos. Por esta razão, em 2017 Jackwood propôs que todos os vírus que circulam em todo o mundo possam ser classificados em sete genogrupos diferentes, sendo os genogrupos 1, 2 e 3 os mais predominantes.

  • O Genogrupo 1 representa todos os classificados como estirpes clássicas.

  • O Genogrupo 2 representa todos os vírus conhecidos como estirpes variantes.

  • O Genogrupo 3 representa as estirpes muito virulentas.

  • Todos os outros vírus que não pertencem a nenhum destes três genogrupos são classificados em grupos de 4 a 7 dependendo das características moleculares do vírus.

O programa GUMBOCHECK oferece dois relatórios diferentes:

1. Uma tabela com a percentagem de semelhança de nucleótidos em comparação com as estirpes referenciadas em cada genogrupo, com a finalidade de saber qual o tipo de vírus presente na amostra e a que genogrupo pertence.

2. Uma árvore filogenética, uma forma gráfica de ver a distância genética entre todas as diferentes estirpes.

  • As árvores filogenéticas são compostas por diferentes ramos ou aglomerados. Cada um dos ramos pertence a um genogrupo específico, pelo que o primeiro passo será ver em que ramo está localizada a estirpe amostrada.

  • Depois de conhecer o genogrupo da estirpe amostrada, a semelhança dos diferentes vírus pode ser comparada olhando para a distância horizontal da árvore. Portanto, quanto maior for a linha horizontal, maior será a distância genética entre duas estirpes específicas.

 


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