A doença respiratória bovina, conhecido pela sigla em inglês como BRD (Bovine Respiratory Disease), é uma doença respiratória comum bovinos domésticos. A BRD é causado por diversos microrganismos, como bactérias, vírus, micoplasmas e, com menor frequência, fungos e parasitas que, uma vez estabelecidos no rebanho, se propagam facilmente de um animal para outro ^{3, 7}.

Por sua natureza multifatorial, o diagnóstico da BRD resulta da combinação das observações clínicas durante um episódio de doença e dos resultados obtidos a partir das amostras enviadas para o laboratório, utilizando um ou mais métodos analíticos em combinação ^2-9. A abordagem holística do diagnóstico é, portanto, fundamental para a interpretação dos resultados e a tomada de decisões. Nesse sentido, é importante saber como agir para obter um diagnóstico rápido e preciso da BRD nos dois cenários possíveis em que nos deparamos com esta doença, ou seja, post-mortem durante a necropsia ou ante-mortem em casos de suspeita clínica.
 

A BRD pode variar na sua apresentação clínica e na gravidade dos sintomas de um animal para outro, com apresentações aguda, subaguda ou crônica. Por esse motivo, a história clínica do surto será de grande ajuda para correlacionar os achados do laboratório com o observado no campo. Na apresentação aguda, a doença pode causar uma alta morbidade e mortalidade. Nesta apresentação, sem excluir fatores não infeciosos ou o efeito do sistema produtivo (fechado ou aberto), habitualmente se vê envolvido o BRSV (vírus respiratório sincicial bovino), embora a Mannheimia haemolytica também possa causar episódios subagudos. Os casos crônicos da BRD cursam com sintomas que persistem durante 3-5 semanas. 

Os patógenos que habitualmente estão envolvidos são as bactérias da família Pasteurellaceae como a P. multocida, H. somni e M. haemolytica, assim como Mycoplasma bovis e com menor frequência bactérias piógenas, oportunistas e comensais. Como acontece nas apresentações agudas, neste caso também é possível detetar por qPCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) a presença de vírus e micoplasmas patógenos respiratórios co-infectando um mesmo pulmão. Por esse motivo é importante conhecer a cronologia do surto para ajudar a discernir quais patógenos foram primários, simultâneos ou secundários no processo de infeção e doença.

A identificação das lesões associadas à BRD é fundamental para orientar qualquer intervenção veterinária dirigida ao controle do surto. Em termos gerais, a BRD causa broncopneumonia, que se caracteriza pela inflamação e consolidação do tecido pulmonar. Os pulmões podem apresentar zonas de tecido avermelhado e congestionado, como consequência da inflamação. Em casos severos pode haver hemorragia do parênquima do órgão. Os pulmões com consolidação do tecido são firmes ao toque e pesados devido à acumulação de exsudados. Ao serem seccionados, mostram uma consistência firme e sólida de cor avermelhada ou acinzentada e não apresentam a textura esponjosa normal.

Em casos agudos da BRD observa-se pleurite fibrinosa, ou seja, inflamação da pleura visceral com acumulação de fibrina, que dá lugar a aderências entre as pleuras e a cavidade torácica. Se a infecção é avançada e envolve bactérias como Mannheimia haemolytica ou Pasteurella multocida, podem ser encontrados abscessos pulmonares em diversos graus de encapsulamento e desenvolvimento. Os gânglios linfáticos regionais, como os traqueobronquiais e mediastínicos, apresentam diversas alterações como aumento de tamanho, avermelhamento, necrose ou presença de abscessos.

Finalmente, em casos agudos de BRD com implicação primária de vírus, é possível observar lesões nasais e traqueais como hiperemia, ulceração e acumulação de secreção mucosa ou purulenta na cavidade nasal e traqueia.
 

Os três tipos de amostras que podem ser coletadas numa exploração para realizar o diagnóstico da Doença Respiratória Bovina (BRD) são sangue, secreções nasais e biópsias de pulmão e vias respiratórias. Cada tipo de amostra fornece informações diferentes, e seu valor diagnóstico depende do curso da doença e do status sanitário do rebanho. Em geral, o sangue é utilizado para triagem de anticorpos (vacinação, infeções recentes de patógenos não endêmicos, colostro), indicando o contato prévio do animal com o patógeno, sem confirmar a presença da doença. As secreções nasais e as amostras de pulmão são usadas para confirmar a presença dos patógenos causadores da BRD antes e após a morte do animal. Neste último caso, também não é possível estabelecer uma relação causal direta, mas todos os resultados clínicos e laboratoriais, em conjunto, orientam o diagnóstico.

O soro obtido de uma amostra de sangue é útil para determinar a presença e, em alguns casos, a quantidade relativa de anticorpos contra um patógeno. Os testes sorológicos só são considerados confirmatórios em casos de populações historicamente negativas que foram infetadas. Qualquer animal positivo deve ser avaliado por um método confirmatório.

Recomenda-se coletar a amostra de sangue por punção venosa usando o sistema de tubo a vácuo. Após a coleta, a amostra deve ser mantida à temperatura ambiente até a formação do coágulo (2 horas) e posteriormente pode ser refrigerada para facilitar a retração total. É necessário evitar estresse excessivo ao segurar o animal durante a coleta e não usar seringas e tubos convencionais que causem hemólise. A hemoglobina liberada pode interferir nos ensaios laboratoriais.

Os anticorpos no soro são rotineiramente detetados por meio de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): este é um método robusto, disponível na maioria dos laboratórios, e é bastante utilizado pela fácil aplicação massiva e automatização ¹⁰. A ELISA é a técnica de triagem de escolha para monitorar populações negativas para certas infeções.

A principal limitação do ELISA para o diagnóstico da BRD está associada à alta prevalência de anticorpos nos animais, seja devido à vacinação, infeção ou colostro ⁸. Isso exige que cada teste ELISA seja confirmado por um segundo teste (testes pareados) com um intervalo de 3-4 semanas, ou que sejam realizadas amostragens sequenciais em intervalos de tempo definidos (perfis sorológicos). Dessa forma, é possível avaliar as mudanças nos níveis de anticorpos entre as coletas sucessivas. No caso das amostras pareadas, é necessário que sejam coletadas dos mesmos animais, analisadas com o mesmo método ELISA (existem várias marcas) e que as diferenças nos níveis entre a primeira e a segunda coleta sejam significativas (2-4 ordens de magnitude). Se as amostras provêm de vitelos com menos de 3-6 meses de vida, a presença de anticorpos colostrais complica a interpretação. Finalmente, é importante observar que a sorologia ELISA em formato comercial, validada e de uso massivo, está disponível apenas para vírus e não para a maioria das bactérias causadoras da BRD.
 

Por se tratar de uma doença confinada ao sistema respiratório, as amostras para confirmar a presença dos patógenos causadores da BRD se limitam às vias respiratórias superiores ou inferiores (antes da morte) e aos pulmões (post-mortem). No entanto, em alguns casos, o agente causador pode induzir lesões extrapulmonares que devem ser avaliadas e registadas durante a necropsia, como acontece com o BVD (vírus da diarreia viral bovina).

Em casos de BRD com mortalidade, a coleta de amostras durante a necropsia é crucial. No entanto, também é importante considerar a coleta de amostras dos animais que conviveram com os afetados, já que a BRD se transmite rapidamente. Por esse motivo, as amostras coletadas in vivo complementam as amostras da necropsia. Em geral, recomenda-se coletar amostras antes da morte de 4-5 indivíduos, idealmente de todos os animais afetados. Essas amostras são obtidas de animais clinicamente afetados, mesmo que os sintomas sejam leves e inespecíficos. A coleta é feita usando zaragatoas secas e estéreis em tubos, que são inseridos nas narinas com firmeza para obter tecido epitelial e a máxima quantidade possível de secreção, evitando traumas. Existem vários tipos de zaragatoas para esse fim ¹. No entanto, um estudo recente demonstra que, para a avaliação qualitativa da flora nasal em bovinos, bem como para a recuperação de M. haemolytica, as zaragatoas convencionais foram tão eficazes quanto os de maior tamanho e protegidas com capa (tipo cateter). Em termos gerais, as zaragatoas comerciais de 15-20 cm de comprimento são adequadas.

Uma vez coletada a amostra, a umidade será suficiente para manter as bactérias vivas até sua chegada ao laboratório, onde podem ser cultivadas, identificadas e, se necessário, realizada um antibiograma. Por esse motivo, não é necessário usar zaragatoas com meio de transporte, desde que a chegada ao laboratório seja no mesmo dia. No caso de H. somni, é crucial coletar a amostra de maneira asséptica e reduzir o tempo de transporte a algumas horas, para se conseguir fazer cultivo bacteriano.

Em um cenário de monitorização da circulação de patógenos envolvidos na BRD, sem mortalidade, mas com sintomas precoces e inespecíficos, o qPCR constitui uma alternativa válida para sua deteção ⁶. Neste caso as zaragatoas podem ser usadas da mesma forma que para o isolamento bacteriano, embora se o tempo de trânsito for prolongado, a dessecação ou a exposição direta à luz degradem parcialmente o material genético. Isso constitui uma limitação, pois o qPCR é baseado na deteção de DNA (principalmente bacteriano e de alguns vírus) e RNA (de alguns vírus), que devem estar intactos para que seja bem-sucedida. Como alternativa, existem matrizes de papel tratadas quimicamente chamadas FTA, acrônimo em inglês de Flinders Technology Associates Card, que inativam os patógenos enquanto fixam e preservam intactos os ácidos nucleicos para sua deteção posterior por qPCR. Dessa forma, a amostra é segura (não infeciosa) e os ácidos nucleicos podem ser detetados por um período mais prolongado, sem as limitações de conservação das amostras não tratadas (cotonetes, tecidos, fluidos corporais, etc.) ¹¹.

Se houver animais com sintomas graves, com indicação para eutanásia ou casos de morte por BRD, será viável coletar amostras de tecido pulmonar e vias respiratórias, tanto para bacteriologia (cultivo ou qPCR conforme o patógeno), quanto para virologia (qPCR) e histopatologia. Isso pode ser feito durante a necropsia de campo por meio de biópsia ou esfregaço do pulmão in situ, ou pode ser encaminhado ao laboratório enviando pedaços representativos da lesão pulmonar e do tecido não lesado do mesmo animal. Dessa forma, o técnico tomará as amostras apropriadas e reduzirá a possibilidade de contaminação cruzada. Deve-se evitar, na medida do possível, a coleta de amostras de animais em avançado estado de decomposição, bem como o envio de pequenos fragmentos dos órgãos. Os cartões FTA voltam a ser uma alternativa válida para a coleta de amostras de cadáveres, fazendo um esfregaço vigoroso e profundo do parênquima do pulmão afetado, e transferência da amostra para o FTA.

Para o envio ao laboratório, as amostras devem ser colocadas em recipientes adequados; os esfregaços no tubo original e os tecidos em recipientes estanques de paredes rígidas. Não devem conter nenhum tipo de conservante, não devem ser lavados com água e devem ser embalados separadamente se pertencerem a animais diferentes. Os tecidos para histopatologia serão enviados imersos em formol tamponado a 10% (v/v), deixando uma câmara de ar correspondente a uma quinta parte do recipiente. Todas as amostras devem ser identificadas individualmente com informações sobre o tecido de origem e a data da coleta. O envio deve ser urgente e em recipiente isotérmico com acumuladores de frio. Os cartões FTA, uma vez desidratados (1-3 horas), não necessitam de refrigeração para o envio. Eles são acompanhados por um agente dessecante e podem ser enviadas em um envelope postal, com as informações pertinentes.
 

A presença de bactérias e micoplasmas associados à BRD é evidenciada por meio de cultura e/ou qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real). Os vírus são detectados por qPCR, pois busca-se apenas evidenciar sua presença. Testes histológicos, como anatomia patológica, imunohistoquímica e hibridação in situ, são menos comuns, embora possam ser complementares aos outros métodos, na medida em que as amostras sejam obtidas e preservadas em condições ideais (frescas e fixadas em formol).

A cultura bacteriana (CB) é um método amplamente utilizado para o diagnóstico da BRD, pois permite a obtenção das bactérias, sua identificação e a realização de antibiogramas. No entanto, a CB requer tempo (dias) para obter resultados e esses dependem da qualidade da amostra (autólise, heterólise). Algumas bactérias da BRD crescem após 24 horas de cultivo (M. haemolytica, P. multocida), enquanto outras não crescem em condições padrão (requerem meios de cultura e condições especiais) ou demoram 3-5 dias a crescer, após passagens sucessivas do cultivo original (H. somni, Mycoplasma bovis) ⁴. Em conjunto, todos esses fatores atrasam a obtenção de resultados e o início do tratamento. Essas desvantagens são compartilhadas, embora em contextos diferentes, com a histopatologia, que fornece informações detalhadas sobre as alterações teciduais causadas pela BRD, como inflamação, necrose, fibrose ou outros padrões histológicos característicos, mas é muito afetada pela qualidade da amostra e requer tempo para execução.

O fundamento do qPCR é comparável ao de "fotocopiar" um documento original. Se o qPCR detetar moléculas de DNA/ARN do patógeno na amostra, ela usa essas moléculas como molde e as replica bilhões de vezes até torná-las detetáveis. Isso faz com que seja um método rápido, muito sensível e específico. O qPCR não depende que o microrganismo esteja vivo (viável) para ser detetado e é menos afetado pela qualidade da amostra do que a CB ou a histopatologia. Por outro lado, o qPCR é realizado imediatamente após a chegada da amostra ao laboratório. Uma mesma amostra, como é o caso dos cartões FTA com tecidos ou secreções, permite a deteção de vários patógenos simultaneamente, pois pode ser realizada em formato multiplex (um tubo, várias PCR) ⁵. O qPCR é atualmente o método de escolha para o diagnóstico e monitoramento da BRD.

Autor: Jaime Maldonado, DVM, MSc, ECPHM Diplomate. Senior Manager, Scientific Manager Unit (HIPRA)

^Referencias:

<sup>1. Crosby WB, Pinnell LJ, Richeson JT, Wolfe C, Castle J, Loy JD, Gow SP, Seo KS, Capik SF, Woolums AR, Morley PS. Does swab type matter? Comparing methods for Mannheimia haemolytica recovery and upper respiratory microbiome characterization in feedlot cattle. Anim Microbiome. 2022 Aug 13;4(1):49. doi: 10.1186/s42523-022-00197-6. PMID: 35964128; PMCID: PMC9375289.
2. Buczinski S, Pardon B. Bovine Respiratory Disease Diagnosis: What Progress Has Been Made in Clinical Diagnosis? Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2020 Jul;36(2):399-423. doi: 10.1016/j.cvfa.2020.03.004. PMID: 32451033.
3. Kudirkiene E, Aagaard AK, Schmidt LMB, Pansri P, Krogh KM, Olsen JE. Occurrence of major and minor pathogens in calves diagnosed with bovine respiratory disease. Vet Microbiol. 2021 Aug;259:109135. doi: 10.1016/j.vetmic.2021.109135. Epub 2021 May 27. PMID: 34090248.
4. Andrés-Lasheras S, Zaheer R, Ha R, Lee C, Jelinski M, McAllister TA. A direct qPCR screening approach to improve the efficiency of Mycoplasma bovis isolation in the frame of a broad surveillance study. J Microbiol Methods. 2020 Feb;169:105805. doi: 10.1016/j.mimet.2019.105805. Epub 2019 Dec 13. PMID: 31837972.
5. Goto Y, Fukunari K, Suzuki T. Multiplex RT-qPCR Application in Early Detection of Bovine Respiratory Disease in Healthy Calves. Viruses. 2023 Mar 2;15(3):669. doi: 10.3390/v15030669. PMID: 36992378; PMCID: PMC10057971.
6. Loy JD. Development and application of molecular diagnostics and proteomics to bovine respiratory disease (BRD). Anim Health Res Rev. 2020 Dec;21(2):164-167. doi: 10.1017/S1466252320000092. Epub 2020 Dec 2. PMID: 33261712.
7. Lachowicz-Wolak A, Klimowicz-Bodys MD, Płoneczka-Janeczko K, Bykowy M, Siedlecka M, Cinciała J, Rypuła K. The Prevalence, Coexistence, and Correlations between Seven Pathogens Detected by a PCR Method from South-Western Poland Dairy Cattle Suffering from Bovine Respiratory Disease. Microorganisms. 2022 Jul 24;10(8):1487. doi: 10.3390/microorganisms10081487. PMID: 35893545; PMCID: PMC9332621.
8. McCarthy MC, O'Grady L, McAloon CG, Mee JF. Longitudinal Prevalence of antibodies to endemic pathogens in bulk tank milk samples from dairy herds engaged or not in contract heifer rearing. Front Vet Sci. 2021 Nov 25;8:785128. doi: 10.3389/fvets.2021.785128. PMID: 34901254; PMCID: PMC8661010.
9. Toker EB, Yeşilbağ K. Molecular characterization and comparison of diagnostic methods for bovine respiratory viruses (BPIV-3, BRSV, BVDV, and BoHV-1) in field samples in northwestern Turkey. Trop Anim Health Prod. 2021 Jan 6;53(1):79. doi: 10.1007/s11250-020-02489-y. PMID: 33409702.
10. Cooke RF, Paiva R, Pohler KG. Technical Note: Using enzyme-linked immunosorbent assays to evaluate humoral responses to vaccination against respiratory viruses in beef cattle. J Anim Sci. 2020 Aug 1;98(8):skaa249. doi: 10.1093/jas/skaa249. PMID: 32761238; PMCID: PMC7454956.
11. Liang X, Chigerwe M, Hietala SK, Crossley BM. Evaluation of Fast Technology Analysis (FTA) Cards as an improved method for specimen collection and shipment targeting viruses associated with Bovine Respiratory Disease Complex. J Virol Methods. 2014 Jun;202:69-72. doi: 10.1016/j.jviromet.2014.02.022. Epub 2014 Mar 20. PMID: 24657552; PMCID: PMC7113650.</sup>