El complejo respiratorio bovino, conocido por sus siglas en inglés como BRD (Bovine Respiratory Disease) es una enfermedad respiratoria común en el ganado bovino doméstico. El BRD es causado por diversos microorganismos como bacterias, virus, micoplasmas y con menor frecuencia hongos y parásitos, que una vez establecidos en un rebaño se propagan fácilmente de un animal a otro ^{3, 7}.

Por su naturaleza multifactorial, el diagnóstico del BRD resulta de la combinación de las observaciones clínicas durante un episodio de enfermedad y los resultados obtenidos a partir de las muestras enviadas al laboratorio, empleando uno o más métodos analíticos en combinación ^2-9. El abordaje holístico del diagnóstico es por tanto fundamental para la interpretación de los resultados y la toma de decisiones. En este sentido, es importante saber cómo actuar para obtener un diagnóstico rápido y preciso del BRD en los dos escenarios posibles en los que nos enfrentamos a esta enfermedad, es decir post-mortem durante la necropsia o ante-mortem en casos de sospecha clínica. 

El BRD puede variar en su presentación clínica y en la gravedad de los síntomas de un animal a otro, con presentaciones aguda, subaguda o crónica. Por este motivo, la historia clínica del brote será de gran ayuda para correlacionar los hallazgos del laboratorio con lo observado en el campo. En la presentación aguda, la enfermedad puede causar una alta morbilidad y mortalidad. En esta presentación, sin excluir factores no infecciosos o el efecto del sistema productivo (cerrado o abierto), habitualmente se ve involucrado el BRSV (virus respiratorio sincitial bovino), aunque Mannheimia haemolytica también puede causar episodios subagudos. 

Los casos crónicos de BRD cursan con síntomas que persisten durante 3-5 semanas. Los patógenos que habitualmente están involucrados son las bacterias de la familia Pasteurellaceae como la P. multocida, H. somni y M. haemolytica, así como Mycoplasma bovis y con menor frecuencia bacterias piógenas, oportunistas y comensales. Como sucede en las presentaciones agudas, en este caso también es posible detectar por qPCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction) la presencia de virus y micoplasmas patógenos respiratorios coinfectando un mismo pulmón. Es por esto por lo que conocer la cronología del brote ayudará a discernir qué patógenos han sido primarios, simultáneos o secundarios en el proceso de infección y enfermedad.

La identificación de las lesiones asociadas al BRD es clave para orientar cualquier intervención veterinaria dirigida al control del brote. En términos generales, el BRD causa bronconeumonía, que se caracteriza por la inflamación y consolidación del tejido pulmonar. Los pulmones pueden presentar zonas de tejido enrojecido y congestivo, como consecuencia de la inflamación. En casos severos puede haber hemorragia del parénquima del órgano. Los pulmones con consolidación del tejido son firmes al tacto y pesados debido al acúmulo de exudados. Al ser seccionados muestran una consistencia firme y sólida de color rojizo o grisáceo y carecen de la textura esponjosa normal. 

En casos agudos de BRD se observa pleuritis fibrinosa, es decir inflamación de la pleura visceral con acumulación de fibrina, que da lugar a adherencias entre las pleuras y la cavidad torácica. Si la infección es avanzada e involucra bacterias como Mannheimia haemolytica o Pasteurella multocida, pueden encontrarse abscesos pulmonares en diversos grados de encapsulamiento y desarrollo. Los ganglios linfáticos regionales, como los traqueobronquiales y mediastínicos, presentan diversas alteraciones como aumento de tamaño, enrojecimiento, necrosis o presencia de abscesos. 

Finalmente, en casos agudos de BRD con implicación primaria de virus, es posible observar lesiones nasales y traqueales como hiperemia, ulceración y acumulación de secreción mucosa o purulenta en cavidad nasal y tráquea.

Los tres tipos de muestras que se pueden tomar en una granja para llevar a cabo el diagnóstico del BRD son la sangre, las secreciones nasales y biopsias de pulmón y vías respiratorias. Cada tipo de muestra proporciona información diferente, y su valor diagnóstico depende del curso de la enfermedad y del estatus sanitario del rebaño. En general, la sangre se emplea para screening de anticuerpos (vacunación, infecciones recientes de patógenos no endémicos, calostro), indicando el contacto previo del animal con el patógeno, sin ser confirmatorio de enfermedad. Las secreciones nasales y las muestras de pulmón se emplean para confirmar la presencia de los patógenos causantes de BRD ante- y post-mortem. En este último caso tampoco es posible establecer una relación causal directa, pero todos los resultados clínicos y de laboratorio, en su conjunto, orientan el diagnóstico. 

El suero obtenido de una muestra de sangre es útil para determinar la presencia y, en algunos casos, la cantidad relativa de anticuerpos frente a un patógeno. Las pruebas serológicas sólo se consideran confirmatorias en casos de poblaciones históricamente negativas que se han infectado. Cualquier animal positivo deberá ser evaluado mediante un método confirmatorio.

Se recomienda tomar la muestra de sangre por punción venosa empleando el sistema de tubo al vacío. Una vez extraída, ésta se debe mantener a temperatura ambiente hasta que se forme el coágulo (2 horas) y posteriormente se puede mantener refrigerada favoreciendo su retracción total. Es necesario evitar estrés excesivo al sujetar al animal durante la toma, y no emplear jeringas y tubos convencionales que causan hemólisis. La hemoglobina liberada puede interferir en los ensayos de laboratorio.

Los anticuerpos en el suero se detectan rutinariamente mediante ELISA (del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay): Este es un método robusto, que está disponible en la mayoría de los laboratorios y su formato de uso masivo y automatizado lo hace muy popular ¹⁰. El ELISA es la técnica de screening de elección para monitorizar poblaciones negativas a ciertas infecciones.

La principal limitación del ELISA para el diagnóstico del BRD se asocia a la alta prevalencia de anticuerpos en los animales, ya sea debido a vacunación, a infección o al encalostramiento ⁸. Esto obliga a que cada prueba ELISA se deba contrastar con una segunda (pruebas pareadas) alejadas 3-4 semanas, o llevar a cabo muestreos seriados a intervalos de tiempo definidos (seroperfiles transversales). De esta manera se podrán valorar cambios en los niveles de anticuerpos entre tomas sucesivas. En el caso de las muestras pareadas, es necesario que se tomen de los mismos animales, que se analicen con el mismo método ELISA (existen diversas marcas) y las diferencias de niveles entre la primera y la segunda toma sean significativas (2-4 órdenes de magnitud). Si las muestras provienen de terneros de menos de 3-6 meses de vida, la presencia de anticuerpos calostrales complica la interpretación. Finalmente hay que tener presente que la serología ELISA en formato comercial, validada y de uso masivo, solo está disponible para virus y no para la mayoría de las bacterias causantes de BRD.

Al tratarse de una enfermedad confinada al sistema respiratorio, las muestras para confirmar la presencia de patógenos causantes de BRD se circunscriben a las vías respiratorias altas o bajas (antemortem) y al pulmón (postmortem). Sin embargo, en algunos casos el agente causal puede inducir lesiones extrapulmonares que deben ser evaluadas y registradas durante la necropsia, como sucede con el BVDV (virus de la diarrea viral bovina). 
En casos de BRD con bajas, la toma de muestras durante la inspección de cadáveres es crucial. Sin embargo, es importante considerar también la toma de muestras de los animales que convivieron con las bajas, ya que el BRD se transmite de manera rápida. Por este motivo, las muestras tomadas in vivo son un complemento a las de necropsia. En general, se aconseja tomar muestras ante-mortem de 4-5 individuos y a ser posible de todas las bajas. Estas muestras se toman de animales clínicamente afectados, aunque los síntomas sean leves e inespecíficos. La toma se realiza utilizando hisopos secos estériles en tubo, que se introducen en las fosas nasales con firmeza para obtener tejido epitelial y la máxima cantidad de secreción posible, evitando traumatismos. Existen varios tipos de hisopos para este fin ¹. Sin embargo, un estudio reciente demuestra que, para la valoración cualitativa de la flora nasal residente en bovinos, así como para la recuperación de M. haemolytica, los hisopos convencionales fueron tan efectivos como aquellos de mayor tamaño y protegidos con funda (del tipo catéter). En términos generales, los hisopos comerciales de 15-20cm de longitud son adecuados.

Una vez recogida la muestra, la humedad de esta será suficiente para mantener las bacterias vivas hasta su llegada al laboratorio y poder cultivarlas, identificarlas y, eventualmente, realizar un antibiograma en caso de tener la necesidad de tratar animales sintomáticos. Por este motivo, no es necesario emplear hisopos con medio de transporte siempre que la llegada al laboratorio no implique días de tránsito. En el caso de H. somni es crucial tomar la muestra de manera aséptica y reducir el tiempo de transporte a pocas horas si se espera el cultivo bacteriano.

En un escenario de monitorización de la circulación de patógenos implicados en BRD, sin mortalidad pero con síntomas precoces inespecíficos , la qPCR constituye una alternativa válida para su detección ⁶. En este caso los hisopos pueden ser empleados de la misma manera que se mencionó para el aislamiento bacteriano, aunque si el tiempo de tránsito es prolongado, la desecación o la exposición a la luz directa degradan parcialmente del material genético. Esto constituye una limitación, ya que la qPCR se basa en la detección del ADN (principalmente bacteriano y de algunos virus) y ARN (de algunos virus) que deben estar intactos para que sea exitosa. Como alternativa, existen las matrices de papel tratadas químicamente llamadas FTA, acrónimo en ingles de Flinders Technology Associates Card, que inactivan los patógenos mientras fijan y preservan intactos los ácidos nucleicos para su posterior detección por qPCR. De esta manera la muestra es segura (no infecciosa) y los ácidos nucleicos se pueden detectar durante un tiempo más prolongado y sin las limitaciones de conservación de las muestras no tratadas (hisopos, tejidos, fluidos corporales, etc.) ¹¹.

Si hay animales con síntomas graves susceptibles de eutanasia o casos de muerte por BRD, será factible tomar muestras de tejido pulmonar y vías respiratorias, tanto para bacteriología (cultivo o qPCR según el patógeno), como para virología (qPCR) e histopatología. Esto se puede llevar a cabo durante la necropsia de campo mediante biopsiado o hisopado de pulmón in situ, o se puede derivar al laboratorio enviando trozos representativos de la lesión pulmonar y del tejido no lesionado de un mismo animal. De esta manera el analista tomará las muestras adecuadas y se reducirá la posibilidad de contaminaciones cruzadas. Hay que evitar, en la medida de lo posible, tomar muestras de animales en avanzado estado de descomposición, así como el envío de trozos pequeños de órgano. Las tarjetas FTA vuelven a ser una alternativa válida para tomar muestras de los cadáveres mediante hisopado vigoroso y profundo del parénquima del pulmón afectado, y transferencia de la muestra a la FTA. 

Para el envío al laboratorio, las muestras se deben colocar en recipientes adecuados; los hisopos en su tubo original y los tejidos en contenedores estancos de paredes rígidas. No llevarán ningún tipo de preservante, no deberán lavarse con agua y se deberán embalar por separado si pertenecen a animales diferentes. Los tejidos para histopatología se enviarán inmersos en formol tamponado al 10% (v/v), dejando una cámara de aire de una quinta parte del envase. Todas las muestras se deben identificar individualmente con la información del tejido de origen y la fecha de recogida. El envío se hará urgente y en contenedor isotermo con acumuladores de frío. Las tarjetas FTA, una vez desecadas (1-3h), no requieren de refrigeración para su envío. Se acompañan de un desecante y pueden enviarse en un sobre de correo con la información pertinente.

La presencia de bacterias y micoplasmas asociados al BRD se evidencia mediante cultivo y/o qPCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction). Los virus se detectan mediante qPCR ya que solo se busca evidenciar su presencia. Las pruebas histológicas como la anatomía patológica, la inmunohistoquímica y la hibridación in situ son menos habituales, aunque pueden ser complementarias a los demás métodos, en la medida en que las muestras se obtengan y preserven en condiciones óptimas (frescas y fijadas en formol).

El cultivo bacteriano (CB) es un método ampliamente utilizado para el diagnóstico de BRD, ya que permite la obtención de las bacterias, su identificación y la realización de antibiogramas. Sin embargo, el CB requiere de tiempo (días) para obtener resultados y estos dependen de la calidad de la muestra (autolisis, heterolisis). Algunas bacterias del BRD crecen tras 24 horas de su siembra (M. haemolytica, P. multocida), mientras que otras no llegan a crecer en condiciones estándar (requieren medios de cultivo y condiciones especiales) o tardan en crecer 3-5 días después de pases sucesivos del cultivo original (H. somni, Mycoplasma bovis) ⁴. En conjunto, todos estos factores retrasan la obtención de resultados y el inicio del tratamiento. Estas desventajas son compartidas, aunque en diferente contexto, con la histopatología, la cual brinda información detallada sobre los cambios tisulares causados por el BRD, como inflamación, necrosis, fibrosis u otros patrones histológicos característicos, pero se ve muy afectada por la calidad de la muestra y requiere tiempo para su ejecución.

El fundamento de la qPCR es homologable al del “fotocopiado” de un documento original. Si la qPCR detecta en la muestra moléculas de ADN/ARN del patógeno, emplea estas moléculas como “molde” y las copia billones de veces hasta hacerlas detectables. Esto hace que sea un método rápido, muy sensible y específico. La qPCR no depende de que el microrganismo esté vivo (viable) para ser detectado, y se ve menos afectada por la calidad de la muestra que el CB o la histopatología. Por otra parte, la qPCR se realiza inmediatamente después de la llegada de la muestra al laboratorio. Una misma muestra, como es el caso de las FTA de tejidos o secreciones, permite detectar varios patógenos simultáneamente, al poderse realizar en formato multiplex (un tubo varias PCR) ⁵. La qPCR es hoy día el método de elección para el diagnóstico y la monitorización del BRD.

Autor: Jaime Maldonado, DVM, MSc, ECPHM Diplomate. Senior Manager, Scientific Manager Unit (HIPRA)

^Referencias:

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